在湖泊水環(huán)境中，磷的分布和賦存形態(tài)會(huì)直接或間接地影響到水體初級(jí)生產(chǎn)力及浮游生物的分布情況。湖泊通常被認(rèn)為是污染源的“匯"，外源磷進(jìn)入湖泊后會(huì)轉(zhuǎn)變成不同形態(tài)。研究表明，不同形態(tài)的磷生物活性及其在水環(huán)境遷移轉(zhuǎn)化和循環(huán)路徑不同，僅僅依靠TP含量來(lái)判斷富營(yíng)養(yǎng)化情況的傳統(tǒng)方法已不能揭示水華暴發(fā)的過(guò)程與機(jī)制。因此，研究磷賦存形態(tài)，發(fā)展分級(jí)提取的方法有利于研究磷素行為，針對(duì)性解決水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題，尤其對(duì)沉積物中磷內(nèi)源釋放的研究和治理具有重要意義。
實(shí)驗(yàn)方法
紫外-可見(jiàn)分光光度法：紫外-可見(jiàn)分光光度法是在190～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測(cè)定的方法。當(dāng)光穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，物質(zhì)對(duì)光的吸收程度隨光的波長(zhǎng)不同而變化。
鉬銻抗比色法：在一定酸度和銻離子存在的情況下，磷酸根與鉬酸銨形成銻磷鉬混合雜多酸，它在常溫下可迅速被抗壞血酸還原為鉬藍(lán)，在700nm波長(zhǎng)下測(cè)定。
實(shí)驗(yàn)儀器
離心管（10ml、25ml）、坩堝、燒杯、容量瓶、移液槍、分析天秤、pH計(jì)、振蕩器、烘箱、高速離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、高壓滅菌鍋、馬弗爐
所需溶液
實(shí)驗(yàn)步驟
使用桿持式淺水型柱狀底泥采樣器采取湖泊表層濕泥回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行磷形態(tài)分析。
1、將坩堝編號(hào)并稱重記錄，取濕泥放入坩堝中，稱量濕泥與坩堝的總重量，放入烘箱60℃烘干，再次記錄其總重量，得出底泥含水率。
2、將烘干的泥研磨后過(guò)100目篩，裝入編號(hào)4號(hào)自封袋中。
烘干
過(guò)篩
3、取50ml離心管并編號(hào)，取過(guò)篩后樣品各0.4g放入離心管中，加入20ml 1 mol/L NH4Cl溶液（溶液1），放入搖床振蕩2h，用高速離心機(jī)3800r離心15min，取上清液過(guò)濾后測(cè)得弱結(jié)合態(tài)磷（LP），不用稀釋；（每步過(guò)后的提取液需要調(diào)節(jié)ph在6-8的范圍，ph過(guò)低，值會(huì)偏低甚至測(cè)不出來(lái)，ph高值會(huì)偏太大。）
提取
4、在離心管中加入20mL純水，振蕩30min后3900r離心15min去除上清液，再加入20ml Na2S2O4-NaHCO3混合溶液（溶液2），振蕩30min，3900r離心15min取上清液過(guò)濾，測(cè)鐵結(jié)合態(tài)磷（Fe-P），稀釋倍數(shù)5~10倍；（溶液有臭雞蛋味，為反應(yīng)正常，沒(méi)有則要注意。沉淀過(guò)夜后，若上層有白色或者黃色懸浮物，需過(guò)濾完了在進(jìn)行測(cè)定。）
5、在離心管中加入20mL純水，振蕩30min后8000r離心5min去除上清液，再加入0.1 mol/L NaOH溶液（溶液3）20ml，振蕩16h后3900r離心15min，取上清液過(guò)濾，稀釋倍數(shù)0~5倍，直接測(cè)鋁結(jié)合態(tài)磷（Al-P）；取50ml比色管并貼標(biāo)簽編號(hào)，取上清液（稀釋倍數(shù)要和鋁結(jié)合態(tài)磷要一致），用純水稀釋至25ml標(biāo)線處，加入25ml氧化劑（溶液4）放入高壓滅菌鍋，120℃下滅菌30min后，測(cè)得總磷（TP）；有機(jī)磷（OP）含量是TP與Al-P差值，總磷的稀釋倍數(shù)要根據(jù)總體積50mL來(lái)反推所用的樣品；
震蕩
6、在離心管中加入20mL純水，振蕩30min后3900r離心15min去除上清液，再加入0.5 mol/L HCl溶液（溶液5）20ml，振蕩16h后3900r離心15min，取上清液過(guò)濾，上清液稀釋5~10倍后，直接測(cè)鈣結(jié)合態(tài)磷（Ca-P）；
7、在離心管中加入20mL去離子水，振蕩30min后3900r離心15min去除上清液，放入烘箱70℃烘干至脫離離心管壁（至少一天一夜），全部倒入編好號(hào)的坩堝中放入馬弗爐（坩堝的標(biāo)簽用橡皮擦掉，用鉛筆寫(xiě)），550℃燒結(jié)2h（馬弗爐有一定的升溫時(shí)間，3h后手動(dòng)關(guān)掉，開(kāi)門(mén)降溫2h以上取出，避免燙傷）；樣品再次放回離心管中，如果燒過(guò)的樣品有結(jié)塊，用藥匙搗碎，加入1 mol/L HCl溶液（溶液6）20ml，振蕩16h后3900r離心15min，取上清液過(guò)濾，比色時(shí)加入同體積1mol/L NaOH至pH=7（同體積是與加入的不稀釋的樣品同體積），測(cè)得殘?jiān)鼞B(tài)磷（Res-P），稀釋5~10倍。
8、將上述所有需要比色的溶液取3ml，加入0.3ml鉬銻抗顯色劑（溶液7）振蕩均勻，顯色40min后在紫外分光光度計(jì)比色；
注：紫外分光光度計(jì)比色過(guò)程：打開(kāi)UV.2.52軟件，再打開(kāi)紫外分光光度計(jì)，進(jìn)行連接儀器，打開(kāi)總磷或者磷酸根標(biāo)曲，將兩個(gè)比色皿洗凈加入去離子水放入比色槽，進(jìn)行自動(dòng)較零后，開(kāi)始樣品比色。
測(cè)樣
數(shù)據(jù)處理
將測(cè)得數(shù)據(jù)導(dǎo)入EXCEL中，定量計(jì)算出各形態(tài)磷含量并整理出具報(bào)告。
數(shù)據(jù)導(dǎo)入
計(jì)算公式如下：
式中：
w-土壤中總磷的含量；A-試料的吸光度值；A0-空白試驗(yàn)的吸光度值；a-校準(zhǔn)曲線的截距；V1-試樣定容體積；b-校準(zhǔn)曲線的斜率；m-試樣量；V2-試料體積；Wdm-土壤干物質(zhì)的量。
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